Ugrás a tartalomhoz Lépj a menübe
 


PCR (Polymerase chaine reaction)- általános tudnivalók

2013.05.02

         A polimeráz láncreakció, vagy röviden PCR (polymerase chain reaction) egy olyan molekuláris biológiai technika, melynek segítségével egy adott DNS szakasz  enzimatikus megsokszorozására van lehetőség in vitro körülmények között. A hagyományos technikákkal szembeni előnye az, hogy a DNS egy fragmentjének vizsgálatára alkalmas. 

Magát a technikát K. B. Mullis dolgozta ki 1983-ban, munkáját 1993-ban kémiai Nobel-díjjal jutalmazták. Az eleredeti eljárás során a kettős szálú DNS-t láncait 96oC-ra történő hevítéssel ketté választották, majd minden ciklusban hozzáadták a DNS-polimeráz enzimet (mert az enzim a magas hőmérsékleten lebomlott), és a ciklushoz szükséges optimális hőmérséklet biztosítását különböző hőfokú vízfürdőbe helyezéssel oldották meg. Az enzim inaktivációjából következő problémát a Taq-polimeráz enzim használatával oldották meg, nevét a Thermus aquaticus nevű baktériumfajról kapta, amely a Yellowstone Nemzeti Park termálvizéből izoláltak. Az enzim alkalmazásával az eljárás kivitelezése egyszerűbbé és automatizálható vált ( ma már a Taq-polimeráz mellett számos más enzim is elérhető, ezekről bővebb leírás a továbbiakban következik majd).  

        A PCR optimális működéséhez elméletileg egyetlen darab DNS molekula is elegendő lenne, az optimális molekulamennyiség a tapasztalatok alapján kb. 105 darab. A kiindulási DNS mennyiség minden egyes ciklusban megduplázódik, így a reakcó végére, azaz 31 ciklust követően a reakcióelegy DNS tartalma mintegy 109- szerese a kezdeti mennyiségnek. 

        A reakció végterméke gélelektroforézis segítségével vizsgálható. 

A PCR reakcióhoz szükség van:

  • templát DNS: genomiális DNS vagy cDNS, amely az amplifikálandó szakaszt tartalmazza
  •  két primer (forward és reverse) amelyek meghatározzák a megsokszorozandó DNS szakasz elejét és végét
  • DNS polimeráz enzim, amely megszintetizálja a DNS szakaszt
  • nukleotidok, melyeket az új szálba épít bele a polimeráz
  • puffer, amely az enzim számára biztosítja a megfelelő fiziko-kémiai környezetet
  • és esetlge szükség lehet plusz magnéziumra is, magnézium-klorid formában

Primerek:

  • Segítségükkel határozható meg a DNS szakasz.
  • Komlementerek az amplifikálandó DNS szakasszal.
  • Rövid, általában 16-30 bázispár hosszúságú mesterséges DNS szakaszok.
  • G-C tartalmuk 40-60% között van. Ennek alapján kiszámolható a primerek Tm-je (melting temperature); amely az a hőmérséklet, ahol a DNS szálak 50%-ban bekötődött a primer. Tm= 4(G+C)+2(A+T)
  • A két primer TM-jének különbsége kevesebb kell, hogy legyen 5oC-nál!!! (Q-PCR esetében <1oC)
  • A primerek annealing hőmérséklete általában 5oC-al alacsonyabb mint a Tm.
  • Belső, önmagával komplementer belső hajtűk és dimerek kerülendők
  • A primerek 5' és 3' vége egymással ne legyen komplementer.
  • CC, GC, CG, GG dunukleotid előnyös a kötődés szempontjából.
  • poliA, poliC szekvencia kerülendő.
  • Primerek típusai: RT-PCR primerek, klónozós primerek (restrikciós enzim hasítási helyekkel az 5' és 3' vegeken), degenerált primerek (hasonló, de nem azonos primerek homológ gének kimutatására), mismatch primerek (mutáns termékek kiszelektálására vad termékből), mutagenezis primerek (mutációt hordozó PCR termék létrehozására), stb.

Egy átlagos PCR ciklus: 

  1. 92oC: 2 perc ---> elődenaturálás, a lehető legtöbb DNS lánc kettéválasztása
  2. 92oC: 30 sec---> denaturálás
  3. 60oC: 30 sec---> annelaing, a primerek bázispárosodása a specifikus DNS szakasszal
  4. 70oC: 1 perc---> szintézis, a primerek által behatárolt DNS szakasz megkettőzése
  5. 72oC: 10 perc---> végső extenzió, a már elindult DNS szintézisek befejezésére

A 2-4 lépéseket kell ismételni, optimálisan 25-30-szor.

 

Mintaelőkészítés:

  • Sejtfal/sejtmembrán lízise: enzimmel, detergenssel, mechanikusan, ozmotikus hatásokkal, NaOH-s (alkalikus) oldattal, szonikálással (ultrahangolás). Fontos a nukleázok gátlása DNase/RNase inhibitorokkal.
  • A DNS-t tartalmazó frakció szeparálása: pl. centrifugálás, filtráció.
  • DNS- tisztítás: pl. szerves extrakció fenol-kloroform-izoamil-alkohollal, etanolos vagy izopropanolos kicsapás, mágneses tisztítás paramágneses gyöngyökkel, stb.
  • DNS- mennyiség mérése: spektrofotometriával vagy fluoriméterrel.

RNS izolálás és cDNS szintézis:

A munkafolyamat során elengedhetetlen az RNase mentes környezet. Fontos, hogy minden munkafolyamatot steril körülmények között végezzünk, és minden oldat, vagyszer RNSase mentes legyen.

Az RNS izolálásnak többféle módja van, ezek közül a legelterjetebbek a következők: 

  • Az úgynevezett "egylépéses" technika, melynek során a sjetszuszpenzióból vagy szövetdarabból elméletileg egylépésben mind a fehérjéket, mind a DNS-t, mind pedig az RNS-t is tudjuk izolálni (ez a technika egy másik bejegyzésben részletes leírásra kerül).
  • Cézium-kloridos ultracentrifugálás, melynek során telített CsCl oldattal képzett sűrűség-gradienst kihasználva végzik el a kiválasztott frakció elkülönítését. 
  • Affinitás kromatográfia, melyet mRNS-ek tisztításához használnak. Lényege, hogy az mRNS poliA-farka a kromatográfiás oszlopot megtöltő gyöngyökhöz kötött oligo-dT molekulákhoz szelektíven kötődik.
  • RNS tisztítása lehetséges továbbá gyári kit-ek segítségével is, tisztítóoszlopokkal kombinálva. Ez a módszer kifejezetten ajánlott, ha nagy mintamennyiséget kell feldogoznunk és/vagy a mintánk olyan kicsi, vagy olyan kevés RNS-t tartalmaz, hogy muszáj azt a legkisebb veszteséggel kinyernünk.

Reverz transzkripció és cDNS szintézis elve:

Az elővilágban előforduló reverz-transzkripció a retrovírusokhoz köthető, melyek RNS genomja a gazdasejtbe bejutva reverz-transzkripcióval (reverz-transzkriptáz enzim segítségével) DNS-sé átíródva képes lesz beintegrálódni a gazdasejt genomjába. 

RT-PCR során a mintánkból kitisztított RNS molekulákat reverz-transzkriptáz segítségével cDNS-sé írjuk át., amely intront nem tartalmaz.

RT-PCR primerek:

  •  Random hexamer primer: nem annyira specifikus, de hosszú reverz transzkripcióra alkalmas, használható rRNS átírására.
  • Oligo(dT) primer: specifikus, de csak poli-A farokkal rendelkező mRNS-ek átírására alkalmas. Poli-A farok nélküli mRNS-t nem tudunk vele kimutatni.
  • Génspecifikus primer: A legspecifikusabb primer típus, de kötődése bizonytalan lehet, gondos tervezést igényel.

 Alap reverz-transzkriptázok:

  • M-MLV reverz-transzkriptáz: Moloney Murine Leukaemia Virus
  • AMV reverz-transzkriptáz: Avian Myeloblastosis Virus
  • FONTOS: MINDKETTŐ RN-ASE H AKTIVITÁSÚ, AZAZ AZ ADOTT ÁTÍRT mRNS-T LE IS BONTJA, ÍGY NEM LESZ TORZ AZ EXPRESSZIÓS MINTÁZAT.

Genomiális DNS kontamináció kiküszöbölésének lehetősei:

  • Intron-differenciál PCR
  • Intront tartalmazó primer tervezése
  • RNS minták kezelése DN-ázzal
  • Negatív kontroll készítése---> -RT-s cső, H2O cső

 

 

 

Hozzászólások

Hozzászólás megtekintése

Hozzászólások megtekintése

Bag Kamagra KelNild

(KelNild, 2019.10.27 15:22)

Propecia Daily Dosage Benign Prostatic Hyperplasia [url=http://bpdrug.com]priligy venta en venezuela[/url] Buy Viagra With Green Dot Card

Cialis Levitra Sales Viagra Ellmowdef

(Ellfriefe, 2019.09.26 20:25)

Real Macrobid Fedex Shipping Correct Viagra Dosage Can Men Use Womans Cialis [url=http://adrugo.com]canadian pharmacy cialis[/url] Surrey Kt12 Viagra Printable Coupons For Propecia Cialis Pas Cher Paiement Securis

Zithromax Boots KelNild

(KelNild, 2019.09.16 12:26)

Buy Propecia Cheapest Dogs Amoxicillin Cheapeast Generic Progesterone Best Website Worldwide On Line [url=http://cialgeneri.com]generic cialis[/url] Lasix Oral

When To Take Allopurinol Lescymn

(Lescymn, 2019.09.06 02:15)

Acticin Want To Buy Medication No Physician Approval Buying Generic On Line Zentel Ups Overnight Shipping [url=http://addrall.com]purchase alli online today[/url] Zithromax Vitamin Interactions Progynova

Buy Renova No Prescription Ellmowdef

(Ellfriefe, 2019.09.05 13:29)

Acheter Viagra Bon Marche Capelli Finasteride Propecia Ciprofloxacin Online Without A Prescia [url=http://cialcost.com]cialis from canada[/url] Viagra Quel Site Levitra Dispersable

Sex Mit Viagra Cialis Levitra Ellmowdef

(Ellfriefe, 2019.08.26 19:17)

Rhine Inc India 401404 Kosten Levitra Ihre Kamagra Tablets Uk [url=http://realviaonline.com]cheap cialis online[/url] Provera On Line

Cialis 5mg. 28 Comprimidos Precio KelNild

(KelNild, 2019.03.11 05:53)

Amoxicillin Tr K Clv Viagaraforsale [url=http://genericvia.com]buy viagra online[/url] Cialis Kaufen Duisburg Buy Cipro Xr Online Viagra Criollo

Canadian Pharmacies Nexium KelNild

(KelNild, 2018.12.27 03:58)

Sale Isotretinoin Roacutan Website Cheapeast Order Cheap Propecia Hair Loss Cheap Tadacip [url=http://ciali10mg.com]cheap cialis online[/url] Where Is The Best Place To Buy Viagara Side Affects Of Cephalexin Novo Tipos De Viagras Amoxicilina Medicine Internet Pharmacy Mastercard Accepted Sale Discount Cash On Delivery Acticin Oregon [url=http://addrall.com]alli diet pills india pharmacy[/url] Priligy Dapoxetine Chlorhydrate Viagra Kaufen Ohne Vorkasse Generic Acticin Internet Shop Shipped Ups [url=http://orderciali.com]cialis from canada[/url] Finasteride Cod Accepted Website Cephalexin And Laying In The Sun Viagra No Prescrip Cialis Italia Senza Ricetta [url=http://yafoc.com]precio proscar propecia[/url] Kamagra Express Delivery